【Purdue案例】液滴加速反应筛选法指导地西泮的多步连续流合成及对反应机理的快速质谱分析研究

众所周知，质谱（MS）对于反应监测方面有着大的用途，其在监测反应动力学以及反应结果方面具有优良的特性，并且MS也有助于识别反应中间体，从而了解化学反应的机理细节。此外，质谱还可以用来研究液滴中的化学反应。以往的研究表明，在电喷雾电离（ESI）形成的微滴中，大多数化学反应的反应都比相应的本体反应速率加快。这种加速现象产生的一部分原因是溶剂蒸发及其对界面处试剂浓度的所带来的影响。这种快速反应的现象可作为筛选方法用于指导微流体与大量反应。利用微滴研究化学反应的另一种方法是利用莱登弗罗斯特效应（Leidenfrost effect）。其原理是当液滴接近被加热的表面时，溶剂开始蒸发，在液滴周围形成一层隔绝蒸汽层。这层防止了溶剂的快速蒸发，并导致液滴悬浮。尽管通过该技术形成的液滴比ESI液滴大，但它们具有一些相同的性质；因此，该液滴中的反应也可以成为指导微流体反应的有效工具。

Purdue大学的H. Thompson教授2017年通过使用地西泮的合成（图1）作为模型系统来说明液滴筛选如何指导地西泮的连续合成，相关成果发表在Org. Process Res. Dev.期刊上。由于其途径中的一个关键步骤涉及N-酰化，因此该成果也可能可以用于指导合成普通生物活性分子中的N-酰化反应，因此具有更深远的意义。虽然微滴中的反应条件并不总是可以直接等同于为微流体级的反应条件，但该方法仍可以作为一种快速的判断预测工具，以预测该条件下，反应在生产级微流体体系中发生的可能性。流动化学系统，再加上ESI-MS的在线监测，能够通过实时反馈快速筛选反应条件。这不仅使原料药的合成更加简便、高效，而且也为人们对反应机理和副产物形成的新认识提供了可能。地西泮可以通过两步合成获得，从5-氯-2-（甲胺基）二苯甲酮（1）与2-卤乙酰氯（2）的N-酰化反应开始，得到酰胺（3）。随后用氨水处理，然后进行环化，得到地西泮4（图1）。对于在液滴中筛选或在流动反应系统中检查每个反应，通过ESI-MS分析立即确定结果。

图1 地西泮的两步合成

N-酰化反应筛选。反应筛选从ESI液滴、莱登弗罗斯特液滴、大量反应和流动反应系统中的N-酰化步骤开始。最初的ESI喷雾（脱机）反应在多个溶剂[二甲基乙酰胺（DMA），四氢呋喃（THF），二甲基甲酰胺（DMF），乙腈（ACN），N-甲基吡咯烷酮（NMP），甲苯]中进行筛选，结果显示相对于相同起始浓度进行的大量反应进行30分钟。在ACN（35×）和甲苯（100×）中反应加速很明显。虽然电喷雾实验是在不同的溶剂中进行的，但在所有实验中分析之前的最后提取操作都是在ACN中进行的。

图2 在甲苯和乙腈（ACN）体系中对于N-乙酰化反应的MS分析

第一步的流动反应条件筛选也从溶剂筛选开始。NMP和DMF表现不佳，转化率有限，杂质较多。在甲苯中，氯化反应发生得很快，转化率很好，而在ACN中，观察到由SN2反应途径产生的副产物（5，7）的形成（图2）。除了溶剂，也对温度和反应时间进行了筛选。随着温度的升高，在大多数情况下，由于副反应越来越多，转化率变底。通过将氯乙酰氯更换为溴乙酰氯，作者找到了副反应发生的机理证据。使用溴乙酰溴的N-酰化反应的预期产物的分子量为367；但是，在m/z 322处看到了一个额外的峰。这证实了在N-酰化过程中溴而非氯的损失。通过柱色谱分离出SN2和N-酰化产物的混合物（来自流动实验），核磁共振分析显示，在3.7和3.9 ppm处有两组不同的峰，分别对应于N-乙酰化和SN2产物的亚甲基质子（图3）。根据上述观察，我们确定甲苯是连续合成地西泮的最佳溶剂。

图3 SN2反应和N-乙酰化反应产物混合物的亚甲基质子的1H NMR信号

除此SN2产物外，在流动实验中还观察到m/z 288处的峰，与环闭合的产物一致。作者认为，这种m/z 288化合物（分子量287）是是由于SN2反应后，羰基对酰氯的亲核攻击形成七元环状内酯的产物。实验结果表明，在微流体系统中，反应溶剂和卤化物的选择可以对反应结果起到控制作用。值得注意的是，这些副反应的结果在微流体实验中观察到，但在相应的液滴实验中却没有。这是由于微流控反应中需要高温和高压条件，但液滴反应却不需要，原因可能是副反应需要更高的能量。

环化反应筛选：对环化反应的预筛选显示，在莱登弗罗斯特液滴中形成地西泮需要更高浓度的氨（图4）。在这些液滴反应中可以观察到反应的加速。在尝试两步连续流地西泮合成之前，首先对先前制备的N-酰化产物3A的第二步进行了微流体筛选。对每种溶剂，筛选其不同的反应温度和反应时间。该物质在ACN和甲苯溶解度小于250μM，但在该浓度下在NMP中溶解良好。幸运的是，在NMP中地西泮的转化效果很好。在研究这一步骤时，另一个有趣的现象是在m/z 303处出现质谱峰。这可能代表甲基位置发生了氮的取代。由于在较低的温度和反应时间中MS中出现这一峰，在较高的温度下消失，所以说这可能是地西泮合成的中间产物。LC-MS分析表明，在整个温度和反应时间筛选中实验中，即使地西泮的数量稳步增加，这种m/z 303的物质的数量也依旧保持相对恒定，这有可能是由于m/z 303的物质的高电离效率淹没了反应混合物中其他化合物的信号。该m/z 303的物质（6）也被认为是地西泮合成中的水解产物。

图4 环化反应筛选中在ACN和甲苯溶剂中使用溴乙酰氯对地西泮合成的结果比较

连续流地西泮合成：作者通过根据上述的实验结果，进而对地西泮合成路线中的每一个合成步骤有了更全面的了解。这些可能的反应途径总结在图5中。在筛选的指导下，作者接下来尝试通过两个连续步骤优化地西泮的合成。通过使用了一个Two-chip反应器系统来更好地控制每个chip的温度和反应时间。第一chip分别以1:2的比例（图6、R1和R2）将5-氯-2-（甲胺基）二苯甲酮和卤代乙酰氯组合在一起，然后将所得N-酰化产物混合物（R3）与甲醇稀释并随后在第二chip中以7倍的过量添加氨/甲醇（R4）。

图5 在地西泮合成中可能存在的一些副反应途径

溶剂筛选再次受到溶解度的限制，尤其是在第二步中添加氨/甲醇时。为了缓解这一问题，在第一反应步骤后加入稀释步骤以提高溶解度。第一步使用甲苯，用甲醇或NMP稀释1:4，可获得良好的溶解性。第一步使用ACN和稀释也是有效的。与之前的流动反应的筛选一样，作者改变了温度和反应时间，以及溴乙酰氯和氯乙酰氯的选择。这次筛选的结果证实了作者以前的观察，特别是在ACN中使用溴乙酰氯容易产生了一些SN2产物。此外，使用溴乙酰氯时，从中间体到地西泮的总转化率较高。

图6采用Chemtrix Labtrix S1全自动微通道连续流反应器两步连续流合成地西泮的装置系统示意图

每个反应的产率使用定量ESI-MS/MS方法进行测定。采用ESI-MS定量方法，在甲苯/甲醇溶剂体系中使用溴乙酰氯，最终以100%产率获得地西泮。这也是Leidenfrost和喷雾微滴中的最佳溶剂体系。

实验结论

1.本研究以地西泮合成为模型反应，展示了MS分析和液滴反应对微流体合成的指导作用。MS不仅可以作为一种分析工具，而且可以作为一种快速预测反应和指导微观合成的方法。

2.使用喷雾和莱登弗罗斯特液滴反应作为筛选中的一步，以指导更大规模的微流体筛选的策略，用于预测反应的总体结果是有效的。虽然在液滴实验的结果与流动反应中所观察到的有一些细微差别，但这些实验仍然可以提供给我们反应是否可行的信息。

3.通过在微流控反应器中分两步连续合成地西泮。其特点是使用混合溶剂系统，以及按顺序排列的两个微流控芯片，从而在每个步骤实现对温度控制的优化。

4.文中涉及微反应采用荷兰Chemtrix 公司的Labtrix S1 自动微反应系统中3223和3224配置执行。

5.作者还发现了地西泮合成中在之前未知的副反应途径。这些结果展示了微流体合成与快速ESI-MS分析相结合的可能性，以识别先前未知的反应途径并指导优化原料药的连续合成。

参考文献

Org. Process Res. Dev. 2017, 21, 1566?1570

公司简介：

深圳市一正科技有限公司，作为荷兰Chemtrix公司（微通道反应器）、英国AM公司（连续搅拌多级反应器、催化加氢系统）、英国NiTech公司（连续结晶仪、连续合成仪）在中国区的独家代理商和技术服务商，为广大高校和企业提供连续合成、在线萃取、连续结晶、在线过滤干燥、在线分析等整套连续工艺解决方案。

公司与复旦大学、南京大学、中山大学、华东理工大学、南京工业大学、浙江工业大学、河北工业大学等高校研究机构合作成立微通道连续流化学联合实验室，致力于推动连续流工艺在有机合成、精细化工、制药行业、能源材料、食品饮料等领域的应用，合作实验室可以为客户的传统间歇釜式工艺在连续流工艺上的转变提供工艺验证、连续流工艺开发工作，促进制药及精细化工企业由传统间歇工艺向绿色、安全、快速、经济的连续工艺转变。

公司与荷兰Chemtrix B.V.在浙江台州、江苏南京合作组建了连续流微通道工业化应用技术中心（以下简称“工业化技术中心”），旨在打造集连续流微通道工艺开发、中试试验、工业化验证、技术交流于一体的综合性连续流微通道应用技术服务中心，以为广大生物医药企业、化工类企业提供专业、完善的智能化连续流工艺整套系统解决方案及一流的技术服务方案。

公司网址：www.e-zheng.com 联系电话：0755-83549661

应用原文可下载下方PDF文件：