【课题背景】

酶作为生物催化剂在医药、精细化工、香料、维生素、食品和纺织工业中被广泛使用。过去几十年中，生物催化剂因其环境友好、安全、良好的化学、区域和立体选择性而得到广泛应用。不过，酶的工业应用仍面临着严峻的挑战。在工业规模上，酶所要面对的一些问题主要在于长期操作的稳定性、活性、反应产物的抑制、对化学反应的选择性、回收率、可重复使用性、易操作性以及在成本上的一些考量。

为了克服这些问题，人们发展了多种技术，如酶固定化，即在不同载体上经过吸附、共价键合、亲和性、离子交换等方法将酶固定化，可大大增强过程控制和稳定性，优化存储和操作条件，并大大简化了回收过程，从而降低了操作成本。

在实际生产过程中，为了简化固定化酶回收过程，提高生产效率，节约生产成本，反应条件的优化和反应器的改进必不可少。工业上广泛使用的是搅拌槽反应器，由于搅拌桨的搅拌作用，经常遇到固定化酶的机械磨损的问题。这种机械磨损效应会导致其固定化骨架磨损，形成难以去除的粉状颗粒，并在回收时导致酶的损失。在这种情况下，问题就会变得比较复杂，并影响工业规模上反应的再现性。

为了避免机械应力作用，瑞典SpinChem公司开发了一种新型的旋转床反应器，它结合了流化床反应器和搅拌槽反应器的优点。如图1，它由机械搅拌轴和四室旋转流动池催化剂室组成，使用时将固定化酶装填到催化剂室即可。由于离心力的作用，反应物反复通过固定化酶，保证了填充床传质的有效性，既保证了酶免受剪切力和研磨的破坏，也确保了酶载体的稳定性，简单沥水就可以快速回收酶无需过滤，大大简化了回收过程，提高了回收效率。

图1 SpinChem旋转床反应器

SpinChem旋转床反应器被广泛应用，例如，在固定化转氨酶催化的反应中，Bornscheuer等人证明了旋转床反应器技术的应用使酶的重复利用更加方便。脂肪酶催化的分子内胺化反应也有报道。近日，阿斯利康的Subhash Pithani等人使用SpinChem的技术，比较和验证了旋转床反应器在药物构建块和原料药工艺开发和制造中的应用。作为本研究的模型反应，选择了最近发表的诺维信435催化的（顺式）-异丙基3-氨基环己酸酯的乙酰化反应（图2所示），该反应在普通釜式反应下以高产率和对映选择性合成酰胺2。用旋转床反应器技术代替原有工艺，考察了搅拌速度、温度以及酶的易回收性对反应的影响。并使用最佳条件来评估了反应的放大能力。

图2 诺维信435催化的乙酰化反应

【材料和方法】

所有的材料和溶剂都是从供应商直接购买使用，没有进一步纯化。诺维信 435购自丹麦诺维信A/S(酶活性9000 PLU/g)。Spinchem RBR S2(最多28毫升树脂体积)，RBR S3(最多69毫升树脂体积)体积)，RBR S4(最大可达0.8 L树脂体积，3D打印定制)反应器，漂莱特 CalBimmo5587，5872，8285，CalB ImmoPlus和Immozyme IMMCALB-T2-150X固定化脂肪酶分别由漂莱特科技和ChiralVision B.V.公司生产，最终由SpinChem公司固定在催化剂盒中。所有反应均在N2氛围中进行。条件优化采用150 mL规模在配有机械搅拌头的SpinChem旋转反应器RBR S2。放大反应分别采用1000 mL规模（SpinChem旋转反应器RBR S3）和10L规模SpinChem旋转反应器RBR S4，3D打印定制）。

所有的转化率都是通过对粗反应混合物的核磁共振分析记录下来的。化合物2的对映体纯度由手性高效液相色谱法测定[（Lux C2 column (4.6 ×150 mm），120bar CO2氛围下的15% 2-丙醇作为洗脱剂]。核磁共振测量采用Bruker Avance IIl光谱仪。FT-IR测量采用配有DiComp (diamond) FT-IR探针的React IR 15（Mettler Toledo）。

【实验部分】

(1S,3R)-异丙基3-乙酰氨基环已环羧酸酯2(循环实验15g规模)

诺维信435（在大孔丙烯酸树脂上固定化的南极假丝酵母脂肪酶B，(活性9000 PLU/g)）购自诺维信。将诺维信 435催化剂粉盒(共含1.5 g酶)安装到配有温度和FTIR探头的SpinChem 旋转床反应器RBR S2上。用氮气冲洗催化剂室，在室温下充入无水异丙酸(150ml)。在注射加入(顺)-异丙基3-氨基环己内酯(1)(15 g. 77.73 mmol)之前，反应器系统先脱气并回填氮气3次，然后加热至50oC。反应混合物在50oC下以500rpm搅拌，并用IH NMR和在线FT-IR对反应过程进行监测。在达到期望的转化率后，用强力搅拌将反应混合物简单地从反应器中抽出，用无水异丙酸(50 ml)冲洗诺维信435酶催化剂室。用同一批酶，重复9次实验过程。

对映体超量分析取样:收集每个批次反应混合物2ml，依次用HCl水溶液(2mL) 和饱和NaHCO3水溶液(2mL)萃取有机层，浓缩后用手性高效液相色谱法分析。

(1S,3R)-异丙基3-乙酰氨基环己内酯2 (1kg规模)

在氮气氛围下向10L的SpinChem旋转床反应器RBR中加入诺维信435 (100 g)。用氮气对旋转床反应器进行冲洗，加入10L无水异丙酸，在强搅拌条件下用氮气脱气三次。先将反应器加热至50℃，再通过漏斗在氮气气氛下添加(顺) 3-氨基环己内酯(1000 g. 5.18 mol)。在50℃下搅拌60min后，将反应混合物排出，用乙酸异丙酯(4L)冲洗酶催化剂室。用4 L草酸溶液(140 g. 0.30 eq. 1.55 mol)洗涤复合有机层，用乙酸异丙酯(3 x 1L)萃取酸性水层，用2 L饱和Na2CO3水溶液洗涤复合有机层。先用2L盐水冲洗有机层，然后进行抛光过滤(滤芯Demicap Proclear PP, 10.0 um)和浓缩，得到粗产品目标化合物88% ee的白色固体(530 g， 98.7% w/w， 2.33mol，校正收率45%)。在上述粗产品中加入TBME (3L)和庚烷(7L)，得到的泥浆被加热到70-80℃，搅拌直到完全溶解。将得到的澄清溶液连续搅拌过夜缓慢冷却至室温(5℃/h)进行结晶，过滤。用冷TBME/庚烷混合物(3:7混合物，200mL)清洗白色固体结晶。40℃减压干燥后，得到白固体的形式的目标化合物2 (460 g. 99% w/w，2.02 mol. 产率39.1%，ee > 98.8%）。

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【阿斯利康案例】使用SpinChem RBR旋转床反应器进行固定化酶促反应